Вера Засулич родилась в деревне Михайловка Гжатского уезда Смоленской губернии в обедневшей дворянской семье. Три года (1852) спустя умер её отец, отставной офицер; мать была вынуждена отправить Веру как одну из трёх сестёр к материально более обеспеченным родственникам (Макулич) в деревню Бяколово близ Гжатска. В 1864 году была отдана в московский частный пансион. По окончании пансиона получила диплом домашней учительницы (1867). Около года служила письмоводительницей у мирового судьи в Серпухове (1867—1868). С начала 1868 года в Санкт-Петербурге устроилась переплётчицей и занималась самообразованием.
Приняла участие в революционных кружках. В мае 1869 года была арестована и в 1869—1871 годах находилась в заключении в связи с «нечаевским делом», затем — в ссылке в Новгородской губернии, затем в Твери. Вновь была арестована за распространение запрещённой литературы и выслана в Солигалич Костромской губернии.
С конца 1873 года в Харькове училась на акушерских курсах. С 1875 жила под надзором полиции, увлекшись учением М. А. Бакунина, вошла в кружок «Южные бунтари» (создан в Киеве, но имел филиалы по всей Украине, объединяя около 25 бывших участников «хождения в народ»; в эту группу входил и Л. Г. Дейч). Вместе с другими «бунтарями»-бакунистами пыталась с помощью фальшивых царских манифестов поднять крестьянское восстание под лозунгом уравнительного передела земли. Жила в дер. Цебулёвке вместе с М. Ф. Фроленко. Когда замысел «бунтарей» осуществить не удалось, Засулич выехала, спасаясь от преследований полиции, в столицу, где было легче затеряться.
24 января (по другим сведениям 28 января) 1878 года пыталась убить выстрелами из пистолета петербургского градоначальника Ф. Ф. Трепова. Причиной покушения стал приказ Трепова о телесном наказании находящегося в заключении революционера Боголюбова (Емельянов А. П.), не пожелавшего приветствовать Трепова в тюремной камере снятием головного убора. Засулич пришла на приём к Трепову и дважды выстрелила ему в живот, тяжело ранив. Была немедленно арестована, но на суде снискала симпатии присяжных заседателей, хотя по закону за подобные преступления полагалось от 15 до 20 лет тюремного заключения. Суд присяжных 31 марта 1878 года полностью оправдал Засулич. Обвинение поддерживал прокурор К. И. Кессель, который впоследствии стал известен своим расследованием по делу о Тилигульской катастрофе. На оправдательный вердикт присяжных повлияла и позиция председателя суда А. Ф. Кони и защитника П. А. Александрова.
Оправдательный приговор был восторженно встречен в обществе и сопровождался манифестацией со стороны собравшейся у здания суда большой массы публики. Весть об оправдании В. Засулич с большим интересом была встречена и за рубежом. Газеты Франции, Германии, Англии, США, Италии и других стран дали подробную информацию о процессе. Во всех этих сообщениях наряду с Верой Засулич неизменно упоминались имена адвоката П. А. Александрова и председательствовавшего в процессе 34-летнего А. Ф. Кони. За ним по заслугам закрепилась слава судьи, не идущего ни на какие компромиссы с совестью, а в либеральных слоях русского общества о нём открыто заговорили как о человеке, стоящем в оппозиции к самодержавию. Отозвалось на оправдательный приговор Засулич и правительство. Министр К. И. Пален обвинял А. Ф. Кони в нарушениях закона и убеждал его уйти в отставку. Кони остался твёрд в своём решении. Тогда начался долгий период его опалы: он был переведён в гражданский департамент судебной палаты, а в 1900 году оставил судебную деятельность. Гнев императора был настолько велик, что он не пощадил и министра юстиции. Граф Пален вскоре был уволен со своего поста «за небрежное ведение дела В. Засулич».
На следующий день после освобождения приговор был опротестован, и полиция издала приказ о поимке Засулич, но она успела скрыться на конспиративной квартире и вскоре, чтобы избежать повторного ареста, была переправлена к своим друзьям в Швецию.
Уже на второй день после оправдания в кабинете министра возникла служебная записка о необходимости упорядочения уголовных положений. Именным указом дела о вооружённом сопротивлении властям, нападении на чинов войска и полиции и вообще должностных лиц при исполнении ими служебных обязанностей, если эти преступления сопровождались убийством или покушением на убийство, нанесением ран, увечий и пр., были переданы военному суду, и виновные лица подлежали наказанию по статье 279 Воинского устава о наказаниях, то есть лишению всех прав состояния и смертной казни. Эта мера была признана своевременной, когда через четыре месяца С. М. Кравчинский убил шефа жандармов Мезенцева.
По настоянию друзей и не желая подвергнуться новому аресту, приказ о котором был отдан после оправдательного приговора, Засулич эмигрировала в Швейцарию, где Г. В. Плеханов, П. Б. Аксельрод, В. Н. Игнатов и Л. Г. Дейч создали первую марксистскую социал-демократическую группу «Освобождение труда».
В 1879 году тайно возвратилась в Россию, вместе с Дейчем и Плехановым примкнула к «Чёрному переделу». Первой из женщин-революционерок испробовала метод индивидуального террора, но и первой же разочаровалась в его результативности. Участвовала в создании группы «Чёрный передел», члены которой (особенно поначалу) отрицали необходимость политической борьбы, не принимали террористической и заговорщической тактики «Народной воли», были сторонниками широкой агитации и пропаганды в массах.
В 1880 году вновь эмигрировала, была заграничным представителем «Красного креста» «Народной воли». В 1883 году, перейдя на позиции марксизма, вошла в состав группы «Освобождение труда», переводила произведения К. Маркса и Ф. Энгельса, вела с ними переписку. Она принимала активное участие в деятельности Международного Товарищества рабочих (II Интернационала) — была представительницей российской социал-демократии на трёх его конгрессах в 1896, 1900 и 1904. Решительно отказавшись от прежних своих взглядов, вела пропаганду идей марксизма, отрицала террор — «следствие чувств и понятий, унаследованных от самодержавия».
С 1894 жила в Лондоне, занималась литературным и научным трудом. Её статьи тех лет касались широкого круга исторических, философских, социально-психологических проблем. Монографии Засулич о Руссо и Вольтере были несколько лет спустя, хотя и с большими цензурными купюрами, изданы в России на русском языке, став первой попыткой марксистского толкования значения обоих мыслителей. В качестве литературного критика Засулич отрецензировала романы С. М. Кравчинского (Степняка), повести В. А. Слепцова «Трудное время». Резко раскритиковала роман П. Д. Боборыкина «По-другому», полагая, что в своих размышлениях об истории русского революционного движения он исказил суть спора между марксистами и народническими публицистами, Д. И. Писаревым и Н. А. Добролюбовым. Засулич утверждала, что «безнадёжная русская идейность» либералов нуждается «в обновлении, которое несёт марксизм», защищала «первородство подлинных русских революционеров», спасая, как она считала, их образы от «вульгаризации и фальсификации».
В 1897—1898 годах жила в Швейцарии.
В 1899 году нелегально приехала в Россию по болгарскому паспорту на имя Велики Дмитриевой. Использовала это имя для публикации своих статей, установила связь с местными социал-демократическими группами России. В Петербурге познакомилась с В. И. Лениным.
В 1900 году вошла в состав редакций «Искры» и «Зари». Участвовала в конгрессах Второго Интернационала.
На Втором съезде РСДРП (1903) примыкала к искровцам меньшинства; после съезда стала одним из лидеров меньшевизма. В 1905 году вернулась в Россию. После революции 1905 года в 1907—1910 годах была одним из «ликвидаторов», то есть сторонников ликвидации подпольных нелегальных партийных структур и создания легальной политической организации.
М. Ф. Фроленко писал о встрече с Засулич в 1912 году, жившей в петербургском доме литераторов:
Февральскую революцию 1917 она расценила как буржуазно-демократическую, с иронией констатировав: «Социал-демократия не желает допустить к власти либералов, полагая, что единственный революционный хороший класс — это пролетариат, а остальные — предатели». В марте 1917 вошла в группу правых меньшевиков-оборонцев «Единство», выступала вместе с ними за продолжение войны до победного конца (эти взгляды изложила в брошюре «Верность союзникам». Пг., 1917). В апреле подписала воззвание к гражданам России, призывая поддерживать Временное правительство, ставшее коалиционным.
В июле 1917, по мере усиления противостояния большевиков и иных политических сил, заняла твёрдую позицию поддержки действующей власти, была избрана в гласные Петроградской Временной городской думы, от имени «старых революционеров» призывала к объединению для защиты от «объединённых армий врага». Перед самой Октябрьской революцией была выдвинута кандидатом в члены Учредительного собрания.
Октябрьскую революцию 1917 Засулич считала контрреволюционным переворотом, прервавшим нормальное политическое развитие буржуазно-демократической революции, и расценивала созданную большевиками систему советской власти зеркальным отражением царского режима. Она утверждала, что новое властвующее большинство просто «подмяло вымирающее от голода и вырождающееся с заткнутым ртом большинство». Утверждая, что большевики «истребляют капиталы, уничтожают крупную промышленность», решалась иногда на публичные выступления (в клубе «Рабочее знамя» 1 апреля 1918). Ленин, критикуя её выступления, тем не менее, признавал, что Засулич является «виднейшим революционером».
«Тяжело жить, не стоит жить», — жаловалась она соратнику по народническому кружку Л. Г. Дейчу, чувствуя неудовлетворённость прожитой жизнью, казнясь совершенными ею ошибками. Тяжело заболев, до последнего часа писала воспоминания, опубликованные посмертно.
Зимой 1919 в её комнате случился пожар. Засулич лишилась родного угла и любимого кота. 70-летняя, никому не нужная старуха сидела на ступеньках и плакала. Её приютили жившие в том же дворе две сестры, но уже началось воспаление лёгких, и первая русская террористка скончалась.
Похоронена на Волковском кладбище.
Первое публицистическое произведение — речь к 50-летию польского восстания 1831 года, опубликованное в переводе на польский язык в сборнике Biblioteka «R?wnosci» (Женева, 1881). Засулич принадлежат очерк истории Международного товарищества рабочих, книги о Ж.-Ж. Руссо (1899, второе издание 1923) и Вольтере (первая русская биография Вольтера «Вольтер. Его жизнь и литературная деятельность», 1893, второе издание 1909), а также литературно-критические статьи о Д. И. Писареве (1900), Н. Г. Чернышевском, С. М. Кравчинском (Степняке), о повести В. А. Слепцова «Трудное время» (1897), романе П. Д. Боборыкина «По-другому», и других литераторах и произведениях. Войдя в редакцию газеты «Искра», опубликовала в ней статью о Н. А. Добролюбове, некрологи о Глебе Успенском и Михайловском.
После революции 1905 года в поисках заработка бралась за переводы прозы Г. Уэллса («Бог динамо», «В дни кометы», «Человек-невидимка»), романа Вольтера «Белый бык». Состояла в Всероссийском обществе писателей и в Всероссийском литературном обществе. В литературно-критических работах Засулич продолжала традиции революционно-демократической литературной критики и публицистики. В последние годы писала мемуары, опубликованные посмертно.
Оправдание Засулич в деле о покушении на генерала Ф. Ф. Трепова вызвало бурное одобрение российской либеральной общественности и осуждение со стороны консервативных кругов.
Князь В. П. Мещерский о процессе над В. Засулич 1878 г.:
Оскар Уайльд посвятил Засулич пьесу «Вера, или Нигилисты» (1880).
В память Веры Засулич были названы улицы в Перми, Свердловске (до 1991, сейчас ул. Одинарка), Самаре, Донецке, Тбилиси (ныне ул. Нино Чхеидзе), Калуге (ныне пер. Григоров), Астрахани (с 1924 по 1936 год, сейчас ул. Валерии Барсовой), Омске (сейчас ул. Ильинской).