Марья Заньковецкая родилась 22 июля (3 августа) 1860 года в деревне Заньки Нежинского уезда Черниговской губернии (ныне Черниговская область) в семье обедневшего помещика. Закончила женскую гимназию в Чернигове.
Уже с юных лет Марья Заньковецкая выступала на любительских концертах. В 1882 году состоялся её дебют на профессиональной сцене. Красивый голос Марьи Константиновны (меццо-сопрано) способствовал её успеху на сцене.
Работала в крупнейших украинских труппах под руководством М. Л. Кропивницкого, М. П. Старицкого, Н. К. Садовского, П. К. Саксаганского, И. К. Карпенко-Карого и др. В 1907 вместе с Садовским организовала первый профессиональный стационарный украинский театр в Киеве. После Октябрьской революции возглавляла Народный театр в Нежине (1918), участвовала (совместно с Саксаганским) в создании Народного театра в Киеве (1918, ныне Украинский драматический театр им. М. Заньковецкой во Львове).
Рано почувствовала влечение к сцене. Родители противились её артистической карьере, но она решила отдаться сцене и дебютировала в «Наталке-Полтавке», в Елисаветграде (1882). Расцвет таланта Заньковецкой относится ко времени её игры в богатой артистическими силами труппе М. Л. Кропивницкого и позже в труппе Н. К. Садовского. Критика, без различия направлений, очень высоко ценила артистическое дарование Заньковецкой. Непосредственное обаяние игры Заньковецкой было неотразимо. В своём сценическом творчестве артистка, не только воплотила национальные образы, но возвысилась до общечеловеческих типов. Её работа прокладывала пути будущему украинского театра. Гастроли же в Москве и Петербурге создали ей большую известность.
В 1906 году Марья Заньковецкая участвовала в создании первого украинского стационарного театра в Киеве, в 1918 — Народного театра (Киев, ныне Украинский драматический театр им. Заньковецкой во Львове).
Заньковецкая играла самые разнообразные роли, начиная с весёлых, вроде Приськи («По ревизии»), и кончая глубоко-драматическими в пьесах «Наймычка», «Пока солнце взойдёт, роса очи выест», «Не так склалося, як ждалося» и др. Наиболее талантливо у неё выходили роли беззаветно любящих и кротких молодых женщин. В Петербурге Заньковецкая с успехом выступала и в русской пьесе А. С. Суворина «Татьяна Репина».
Умерла 4 октября 1934 года, похоронена в Киеве на Байковом кладбище.