Владимир Лысенко родился 4 января 1956 года в Одессе в семье преподавателей. Отец — Лысенко Николай Александрович, мать — Лысенко Анастасия Кузьминична.
Жена — Лысенко Любовь Михайловна, доктор исторических наук — преподает историю в МГПУ. Сыновья — Михаил и Владимир.
Юность провел в городе Запорожье. В 1972 году, окончив с золотой медалью школу, поступил на исторический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова, который окончил с красным дипломом. С 1979 по 1981 год учился в аспирантуре МГУ, защитил диссертацию по проблеме партийных систем на соискание учёной степени кандидата философских наук. В 1995 году защитил докторскую диссертацию в области политических наук на тему «Развитие федеративных отношений в современной России». Профессор.
C 1980 по 1990 год работал преподавателем общественных наук в ММАИ имени С. Орджоникидзе (ассистент, старший преподаватель, доцент). С 1994 года — президент Института современной политики. Один из ведущих специалистов в области проблем федерализма, региональной политики и межнациональных отношений.
До 2009 года В. Лысенко — профессор кафедры прикладной политологии факультета прикладной политологии Государственного университета «Высшая школа экономики» (ГУ-ВШЭ).
В 1985 году создал студенческий политклуб МАИ «Орбита», который стал одним из наиболее активных и посещаемых в Москве в годы перестройки. В 1987 году стал одним из основателей историко-просветительского общества «Мемориал». В 1989—1990 годах стал одним из учредителей «Демократической платформы в КПСС» — крупнейшего оппозиционного течения внутри Компартии времен перестройки. Был избран делегатом Учредительного съезда КП РСФСР и XXVIII съезда КПСС. В июне 1990 выступал в КДС от имени Демократической платформы с программой реформирования КПСС в социал-демократическую партию.
После отказа большинства съезда пойти по пути реформирования КПСС вместе с другими делегатами съезда от Демплатформы покинул ряды КПСС.
В ноябре 1990 года стал основателем и одним из сопредседателей Республиканской партии России, возникшей на базе Демократической платформы в КПСС. Занимал пост председателя партии. С 2005 года — член политсовета партии.
В начале 1991 года был инициатором создании «Демократического конгресса», коалиции антикоммунистических организаций союзных республик (ДемРоссия, РПРФ, «Рух», Партия демократического возрождения Украины и. т.д.). В декабре 1991 года участвовал в образовании Конгресса демократических сил республик и национальных образований в составе РФ.
На Съезде народных депутатов РФ был одним из основателей фракции «Согласие ради прогресса».
По собственной оценке, до 1987 года придерживался либерально-коммунистических взглядов, с 1987 по 1990 год — социал-демократических, и с 1991 года — социально-либеральных.
В 1990 году был выдвинут коллективом МАИ кандидатом в народные депутаты РСФСР и затем избран депутатом.
В 1991—1992 годах работал заместителем министра России по национальной политике, принимая личное участие в урегулировании большинства конфликтов на территории бывшего СССР. Являлся руководителем рабочей группы Совета безопасности России по подготовке Концепции национальной политики России на Северном Кавказе. За годы работы в Комитете по делам Федерации и в Миннаце объездил все субъекты Российской Федерации.
В октябре 1993 года года во время разгона Верховного Совета встал на сторону президента.
В декабре 1993 года был избран депутат Государственной думы России (по списку «Яблока»). В 1994 году вышел из фракции «Яблоко», был членом депутатских групп «Регионы России», «Российские регионы». С 1994 — член российской делегации в Межпарламентской ассамблее стран СНГ.
В конце 1994 года был решительным противником ввода российских войск а Чечню. Вылетал в Грозный для освобождения из чеченского плена российских военнослужащих.
В 1995 году на выборах в Государственную думу был одним из создателей избирательного объединения «Памфилова. Гуров. В. Лысенко» — Республиканская партия Российской Федерации. Блок тогда набрал 1,6 % — около 1 млн. голосов избирателей, но в Думу не прошёл.
В 1995 и 1999 годах побеждал на выборах в Государственную думу в Ленинградском избирательном округе Москвы. На выборах 2003 года в этом же округе не был избран в Думу.
С 1993 года работал в Комитете Государственной Думы по делам Федерации и региональной политике в должности заместителя председателя. Автор и соавтор более 50 законов, в том числе важнейшего федеративного закона «О принципах и порядке разграничения предметов ведения и полномочий между органами государственной власти РФ и органами государственной власти субъектов РФ» (1999), законопроекта «Об альтернативной гражданской службе» (2001).