Макфарлейн получил свой аттестат в школе города Кент (штат Коннектикут) от директора, которой ранее часто упрекал Макфарлейна за его «тупой» юмор. Сет пошёл учиться анимационному делу в «Дизайнерскую школу Род Айленда» (Rhode Island School of Design), после окончания которой он был полностью поглощён созданием «Гриффинов». Ещё учась в колледже, он создал небольшой мультфильм под названием «Жизнь Ларри» (The Life of Larry and Larry & Steve), и этот мультфильм и стал прародителем «Гриффинов». Два года спустя он создал продолжение — «Ларри и Стив». После обучения его наняла «Hanna-Barbera Productions» (производство «Ханна-Барбера») и уже скоро он работал аниматором и сценаристом на всемирно известном «Cartoon Network» в сериале под названием «Cartoon Cartoons». Этот сериал включал в себя серии мультфильмов «Джонни Браво», «Лаборатория Декстера» и «Коровка и Петушок». Он также писал для анимационного сериала «Эйс Вентура: Розыск домашних животных».
В 1996 году Макфарлейн создаёт продолжение фильма «Жизнь Ларри» для «Hanna-Barbera Productions» и называет этот мультфильм «Ларри и Стив» (англ. «Larry and Steve»). Главными героями был неуклюжий, средних лет мужчина по имени Ларри и его высокообразованный, но циничный пёс Стив. Серии стали показывать по телевидению на каналах «Cartoon Network» и «World Premiere Toons». Через некоторое время продюсеры канала FOX, увидев эпизоды с Ларри, заключили контракт с Макфарлейном на создание сериала, базирующегося на этих персонажах. Непосредственно до начала «Гриффинов» в 1998 году, Фрэд Сейбер (который и пригласил Макфарлейна работать в «Hanna-Barbera») предложил ему написать сценарий и быть продюсером сериала «Zoomates» для шоу «Oh Yeah! Cartoons» производства «Frederator Studios», которое должно будет выйти на канале «Nickelodeon». Макфарлейн очень хорошо играет на фортепиано и прекрасно поёт. Его голос часто сравнивают с голосом Фрэнка Синатры. Он большой фанат мюзиклов и часто вставляет музыкальные сцены в свои шоу.
Сет Макфарлейн озвучивает множество главных персонажей в телевизионном сериале «Гриффины», где рассказывается о жизни семьи Гриффинов. В этом сериале Сет одновременно озвучивает Питера — главу семьи, Брайана — красноречивого и рационального пса-алкоголика, Стьюи — малыша, с комичным интеллектом, страдающего манией величия, Гленна Куагмира, сексуального маньяка и соседа «Гриффинов», а также Тома Такера, ведущего местных новостей. Существуют и другие, менее значительные работы с его участием в сериале. Кстати, в жизни голос Макфарлейна полностью совпадает с голосом Брайана.
«Американский папаша!» — с 1 мая 2005 года сериал стал выходить регулярно на канале FOX. Сюжет сериала развивается вокруг семьи Смитов. Отец семьи по имени Стэн — фанатичный борец с террористами из ЦРУ. Он — любящий муж и отец двух своих детей, а также двух нестандартных обитателей его дома: пришельца, который спас ему жизнь, и говорящей золотой рыбки с пересаженным мозгом лыжника из Восточной Германии, который участвовал в зимней Олимпиаде 1986 года.
В 2006 году «Американский папаша» был продлён ещё на два сезона. В этом сериале Сет озвучивает голоса Стэна и Роджера. А родная сестра Сета, Рейчел Макфарлейн (Rachael MacFarlane), озвучивает в этом сериале дочь Стэна по имени Хейли.
Макфарлейн — большой поклонник сериала «Звёздный путь» и даже снимался в роли инженера Энсин (мичман) Ривер (англ. Ensign Rivers) в сериале «Энтерпрайз» в третьем сезоне в серии «Забытое» (3.20) и в четвёртом сезоне в серии «Бедствие» (4.15). C этого момента Патрик Стюарт получил роль директора ЦРУ в сериале «Американский папочка» (и конечно его самую любимую роль Жана-Люка Пикара в одном из эпизодов «Гриффинов»). Макфарлейн был приглашён в Гарвард на открытую лекцию в 2006 году. 7 июля 2006 года Макфарлейн разговаривал за четверых, а именно: за себя, за Питера, за Стьюи и Гленна Куэгмайра. Разговаривая их голосами, он вёл своё выступление. По окончании выступления ему была присвоена учёная степень. Макфарлейн также выступал в университете Джорджа Вашингтона 16 сентября 2006 года и показал эпизод, который транслировали по телевидению на следующий день. 5 ноября 2006 года Макфарлейн был приглашён в сериал «Война дома» (англ. «The War At Home»), где играл безымянную персону, известную как «Парень Хиллари». Он играл очень пожилого человека, который никак не может встречаться с Хиллари. Персонаж Макфарлейна чем-то напоминает его самого в жизни.