Сантьяго Рамон-и-Кахаль родился 1 мая 1852 года в испанском городке Петилья-де-Арагон. В детстве он учился сначала ремеслу парикмахера, а затем сапожника, но мечтал стать художником — его способности к рисованию видны в иллюстрациях к опубликованным работам. Однако его отец, профессор прикладной анатомии в университете Сарагосы, убедил его заняться медициной, что Рамон-и-Кахаль и сделал. Вместе с отцом они подготовили к выпуску анатомический атлас, рисунки к которому были выполнены Рамоном-и-Кахалем, однако книга не была опубликована.
В 1873 году в Сарагосе Рамон-и-Кахаль сдал экзамены на медицинскую лицензию и поступил на армейскую службу в качестве врача. Он принял участие в экспедиции на Кубу 1874-75 годов, во время которой переболел малярией и туберкулёзом. По возвращении в Испанию ему предложили пост ассистента в школе анатомии медицинского факультета университета Сарагосы (1875), а затем, по его личной просьбе, назначили директором Музея Сарагосы (1879). В 1877 году в Мадриде Рамон-и-Кахаль получил звание доктора медицины, и в 1883 году был назначен профессором описательной и общей анатомии в Валенсии. В 1887 году он стал профессором гистологии и патологической анатомии в Барселоне, а в 1892 году занял такой же пост в Мадриде. В 1900—1901 годах Рамон-и-Кахаль был директором Национального института гигиены и Института биологических исследований.
Первые научные работы Рамона-и-Кахаля были опубликованы в 1880 году. Среди важнейших трудов учёного: «Руководство по гистологии и микрографии» (1889), «Элементы гистологии» — переработанное издание первой книги (1897), «Руководство по общей патологической анатомии» (1890). В дополнение следует упомянуть «Новые представления о гистологической анатомии и нервных центрах» (1894), «Сборник статей о нервной системе человека и позвоночных» (1897—1899), «Сетчатка глаза позвоночных» (1894).
Помимо этих работ Рамон-и-Кахаль опубликовал более сотни статей в испанских и французских научных журналах, большая часть которых касалась гистологической структуры нервной системы и других тканей, а также различных аспектов общей патологии. Эти статьи разошлись по многим изданиям, некоторые были собраны Рамоном-и-Кахалем и его учениками в «Ежеквартальном обзоре нормальной и патологической гистологии» (начал издаваться в 1888 году), затем многие появлялись под заголовком «Сообщения лаборатории биологических исследований Мадридского университета».
Работы Рамона-и-Кахаля по структуре коры головного мозга в 1900—1901 годах были частично объединены и переведены на немецкий язык Й. Бреслером.
Перу Рамона-и-Кахаля принадлежат «Правила научных исследований», выдержавшие шесть изданий на испанском языке и перевод на немецкий (1933).
За свою жизнь Рамон-и-Кахаль заслужил немало наград и почетных званий: член Мадридской королевской академии наук (1895), член Мадридской королевской медицинской академии (1897), член Испанского общества естественной истории (1897), член Лиссабонской академии наук (1897), почётный член Испанской академии медицины и хирургии. Его также избрали почётным доктором медицины Кембриджского (1894), Вюрцбургского университетов (1896) и доктором философии университета Кларка (Уорчестер, США, 1899).
Рамон-и-Кахаль являлся членом-корреспондентом Медико-физиологического общества Вюрцбурга (1895), Медицинского общества Берлина (1895), Общества медицинских наук Лиссабона (1896), Венского общества психиатрии и неврологии (1896), Парижского биологического общества (1887), Национальной медицинской академии Лимы (1897), Институтского общества Коимбры (1898); почётным членом Итальянского психиатрического общества (1887) и Медицинского общества Гента (Бельгия, 1900). В 1906 году он был избран членом-корреспондентом Парижской медицинской академии, в 1916 был избран в Шведскую академию наук.
Рамону-и-Кахалю присвоено несколько наград, включая Rubio Prize за «Элементы гистологии», Fauvelle Prize Парижского биологического общества (1896), Приз Москвы, присуждаемый Московской городской думой за работы в области медицины каждые три года (1897). В 1900 году на Международном медицинском конгрессе в Париже его чествовали за службу науке и человечеству. В 1905 году Берлинская королевская академия наук наградила Рамона-и-Кахаля медалью Гельмгольца. В 1906 году учёного ожидала высочайшая научная награда: Нобелевская премия в области физиологии и медицины за работы по структуре нервной системы, которую он разделил с Камилло Гольджи.
В марте 1904 года Рамона-и-Кахаля пригласили в Лондон, где он прочёл лекцию перед Королевским обществом, и в университет Кларка в Уорчестере, США, для выступления с тремя лекциями о структуре человеческого мозга и последних исследованиях в этой области. В 1952 году Институт Каролины опубликовал книгу объемом 651 страница в честь столетнего юбилея учёного (Acta Physiol. Scand., Vol. 29, Suppl. 106).
В 1879 году Рамон-и-Кахаль женился на Донье Сильверии Фаньянас Гарсия. В браке у них родилось четыре дочери и три сына. Умер Рамон-и-Кахаль 17 октября 1934 года в Мадриде.