Рита Леви-Монтальчини родилась в Турине четвёртым ребёнком (вместе с её сестрой-близнецом Паолой) в сефардской еврейской семье. Её отец, Адамо Леви, был инженером-электриком и математиком; мать, Аделе Монтальчини, художницей. После окончания медицинской школы в 1936 году, Леви-Монтальчини стала ассистентом физиолога Джузеппе Леви (Giuseppe Levi, 1872—1965), но вскоре после введения правительством Муссолини новых антисемитских законов, запрещавших евреям академические и профессиональные карьеры, она была отстранена от работы. В 1943 году Леви-Монтальчини с семьёй бежали во Флоренцию и вернулись в Турин только после окончания военных действий.
Брат — Джино Леви — известный архитектор. Сестра — Паола Леви-Монтальчини (Paola Levi Montalcini, 1909—2000), художница.