Николай Семашко родился в семье педагога в селе Ливенское Елецкого уезда Орловской губернии (сейчас Липецкая область). Его мать — сестра Г. В. Плеханова
В 1891 году, окончив Елецкую мужскую гимназию (в которой учился вместе с М. Пришвиным), поступил на медицинский факультет Московского университета. В 1893 году стал членом марксистского кружка. В 1895 году за участие в революционном движении был арестован и сослан на родину, в село Ливенское, под гласный полицейский надзор.
В 1901 году окончил медицинский факультет Казанского университета, работал врачом в Орловской и Самарской губернии. С 1904 года был активным членом Нижегородского комитета РСДРП; во время революционных событий 1905 стал одним из организаторов забастовки на Сормовском заводе, за что был вновь арестован.
В 1906 году эмигрировал в Швейцарию, жил в Женеве, где встретился с Владимиром Лениным. В августе 1907 года Семашко был делегатом от Женевской большевистской организации на Штутгартском конгрессе 2-го Интернационала. Арестовывался швейцарской полицией, после того, как арестованная по делу о Тифлисской экспроприации Сарра Равич отправила ему письмо из тюрьмы.
В 1908 вместе с большевистским заграничным центром переехал в Париж, где до 1910 работал секретарем Заграничного бюро ЦК РСДРП; участвовал в работе Партийной школы в Лонжюмо (1911).
На 6-й (Пражской) Всероссийской конференции РСДРП (1912) Семашко выступил с докладом по вопросу о страховании рабочих; составленный им проект резолюции был отредактирован Лениным и принят конференцией. В 1913 Семашко участвовал в социал-демократическом движении в Сербии и Болгарии; в начале Первой мировой войны был интернирован. Вернувшись в сентябре 1917 в Москву, был избран от фракции большевиков председателем Пятницкой районной управы. Делегат 6-го съезда РСДРП (б). Участвовал в подготовке Октябрьского вооруженного восстания в Москве, организовал медицинскую помощь его участникам.
После Октябрьской социалистической революции Семашко — заведующий медико-санитарным отделом Моссовета; с июля 1918 до 1930 он занимал пост наркома здравоохранения РСФСР. Руководил вскрытием тела Ленина. Под руководством Семашко проводилась работа по борьбе с эпидемиями, заложены основы советского здравоохранения, созданы системы охраны материнства и младенчества, охраны здоровья детей и подростков, сеть научно-исследовательских медицинских институтов.
В 1921—1949 Семашко — профессор, заведующий кафедрой социальной гигиены медицинского факультета Московского университета (с 1930 — 1-й Московский медицинский институт).
С 1930 по 1936 годы Семашко работал во ВЦИК, занимая должности члена Президиума, председателя Деткомиссии (ей была поручена борьба с беспризорностью, руководство лечебно-профилактической работой в детских оздоровительных учреждениях). В 1945—1949 — директор института школьной гигиены АПН РСФСР и одновременно (1947—1949) — института организации здравоохранения и истории медицины АМН СССР (с 1965 ВНИИ социальной гигиены и организации здравоохранения им. Семашко). Инициатор создания Центральной медицинской библиотеки (1918), Дома учёных (1922) в Москве. В 1927—1936 главный редактор Большой медицинской энциклопедии. Первый председатель Высшего совета по делам физической культуры и спорта (с 1923), председатель Всесоюзного гигиенического общества (1940—1949). Делегат 10, 12—16-го съездов ВКП(б).
Был женат. Дочь Елена (1908—1983, по мужу Фаробина), долгие годы — ответственный сотрудник Министерства здравоохранения.
«Хорошего врача прокормит народ, а плохие нам не нужны.»