Впервые упоминается в 1498 в связи с женитьбой и покупкой дома в родном городе. В 1519—1529 Мостарт был в Мехелене придворным художником Маргариты Австрийской, регентши Нидерландов.
Испытал влияние другого харлемского мастера — Гертгена тот Синт Янса. Автор работ на религиозные сюжеты, портретов, пейзажей. Его Портрет африканца (1520—1530, Рийксмузеум) отходит от традиционной трактовки образа, принятого в сюжетах «Поклонения волхвов».
Наиболее знаменит его воображаемый Пейзаж Вест-Индии (ок. 1545), в его основе — записки о путешествии испанского конкистадора Франсиско Васкеса де Коронадо в Нью-Мексико и Аризону (1540—1542). Интерес Мостарта к примитиву виден и в его картине Первая семья, где Адам и Ева представлены как своего рода первобытные туземцы.
Многие работы Мостарта разрушил Большой Харлемский пожар (1576).
Картина Мостарта Се человек находилась в церкви Богоматери всех скорбящих на Ордынке, в Москве (ныне — в ГМИИ). Исследователи не исключают, что именно ее описывает князь Мышкин в романе Достоевского Идиот.