Мария Леопольдина родилась в семье эрцгерцога Леопольда V, герцога Тирольского и Клаудии Медичи. По отцу — внучка Карла II Австрийского и Марии Анны Баварской. По матери — великого герцога Тосканского Фердинанда I и Кристины Лотарингской. Через месяц после её рождения, 13 сентября 1632 года, скончался её отец.
2 июля 1648 года в Линце стала второй супругой императора Фердинанда III. В 1646 году скончалась его первая супруга — Мария Анна Испанская. Фердинанд III приходился Марии Леопольдине двоюродным братом. В браке родился сын, эрцгерцог Карл Йозеф (1649—1664). Мария Леопольдина скончалась вскоре после родов. Похоронена в Императорском склепе. Через 2 года, в 1651 году, император Фердинанд III заключил третий брак с принцессой Элеонорой Мантуанской (1630—1686).
Племянница Марии Леопольдины, Клавдия Фелисита, также стала императрицей Священной Римской империи, выйдя замуж за сына Фердинанда III и Марии Анны Испанской — императора Леопольда I.