Работая в Бременском музее, заинтересовался культурами народов Африки, несколько лет изучал их по музейным коллекциям и литературе; издал кн. Происхождение африканских культур (1898). В 1904 ему удалось, собрав средства, совершить свою первую экспедицию в Африку (в бассейн р. Касаи и Нижнего Конго). В ходе этой и последующих экспедиций, Фробениусу удалось собрать большой материал по этнографии и культуре народов Африки. Впервые в этнографии ввёл метод систематического картографирования явлений культуры. Один из основоположников диффузионистской теории культурных кругов. На территории Африканского континента Фробениус выделяет несколько культурных кругов, т. е. целостных комплексов явлений культуры, характерных для определённой местности.
Две африканские коллекции Фробениуса (археологическая и этнографическая) находятся в фондах петербургской Кунсткамеры (отдел этнографии Африки).
Выдвинул теорию о культуре как особом социальном организме, имеющем мистическое начало — «душу» («paideuma»). Не культура является продуктом человека, а люди — продукт культуры. Подчёркивал богатство и самобытность африканских культур, но ограничивал их содержание анахроническими традициями. В 1925 основал в Франкфурте-на-Майне исследовательский институт морфологии культуры (с 1946 Институт Фробениуса). Прослеживается влияние теорий Фробениуса на историософию Шпенглера.
Фробениус различал две первичные культуры: матриархальную и патриархальную. К первой относятся русские, немцы и африканские народы, ко второй — англосаксы, арабы-берберы, романские народы и др. Патриархальным народам присуще мировоззрение «из пещеры», активность в покорении природы, животное начало, рациональность и магия. Для мировоззрения матриархальных культур характерно растительное начало и единство с природой, это — мировоззрение просторов и эмоций. По мнению Фробениуса, в истории попеременно доминируют либо одни, либо другие. Этот процесс смены лидерства выступает источником развития человечества.
Лео Фробениус был другом американского поэта Эзры Паунда, переписываясь с ним с 1920-х годов. Темы переписки нашли своё отражение в эпосе Паунда Cantos.
Экспедиция Фробениуса 1908 года на западный берег Африки, в область между Того и Либерией (выявление остатков древней цивилизации йоруба) может служить непосредственным источником рассказа В. Я. Брюсова Элули, сын Элули.
В истории современной Африки наследие Фробениуса было значительно переосмысленно и оказало влияние на идеологию негритюда.