Окончил Туринский университет и в 1770 получил степень доктора медицины. В 1770—1783 — практикующий врач и аптекарь. С 1772 практиковал в Париже, где приобрел некоторую известность и стал лейб-медиком при дворе герцога Орлеанского. Одновременно занимался изучением естественных наук и исследованиями в области химии, организацией химических и металлургических производств. С 1780 — член Парижской Академии наук. В 1784 Бертолле получил должность правительственного инспектора государственных красильных фабрик, а в 1792 был назначен главным смотрителем монетного дела. В 1794 Бертолле стал профессором Высшей нормальной школы и Политехнической школы в Париже.
В период Революции и Империи Бертолле много занимался вопросами, связанными с национальной обороной. В 1798—1799 в качестве научного консультанта Наполеона Бонапарта принимал участие в Египетском походе. В 1804 получил титул графа и стал сенатором округа Монпелье.
В 1807 Бертолле оставил официальную службу и поселился в парижском предместье Аркёй, где основал своеобразное научное общество, просуществовавшее 10 лет (1807—1817). В состав общества входило небольшое число выдающихся учёных Франции (П. Лаплас, А. Гумбольдт, Ж. Л. Гей-Люссак и др.); общество регулярно собиралось под председательством Бертолле или Лапласа и обсуждало различные научные проблемы. «Мемуары Аркёйского общества» получили широкую известность в учёном мире.
В отличие от многих своих коллег — современников и деятелей эпохи Французской революции, Бертолле избежал опалы после падения Наполеона и реставрации Бурбонов; он даже получил от Людовика XVIII титул пэра Франции. В последние годы жизни Бертолле полностью отошёл от научной работы из-за тяжёлой болезни.
Основные исследования Бертолле относятся к неорганической химии, химии растворов и сплавов. Он установил состав аммиака (1785), болотного газа (1786), синильной кислоты (1786), сероводорода (1788). Открыл соли хлорноватистой и хлорноватой кислот (1786), в частности, хлорат калия («бертолетова соль»); открыл (1788) нитрид серебра («бертолетово гремучее серебро»). В 1787 Бертолле описал метод окислительно-восстановительного титрования. Занимался также прикладной химией (например, крашением ткани); первым применил хлор для отбеливания бумаги и тканей.
Как все современники, Бертолле начинал научную деятельность, опираясь на теорию флогистона; после 1785 перешёл на позиции кислородной теории. В 1786—1787 он вместе с А. Л. Лавуазье, Л. Б. Гитоном де Морво и А. Ф. Фуркруа разработал новую химическую номенклатуру и классификацию тел. Совместно с Лавуазье и другими учёными основал (1789) журнал «Annales de chimie».
На основании наблюдений за процессами выпадения осадков из растворов Бертолле пришёл в выводу о зависимости направления реакций и состава образующихся соединений от массы реагентов и условий протекания реакций. Эти взгляды он высказал в своем «Опыте химической статики» (1803), в котором утверждал, что элементы могут соединяться друг с другом в любых пропорциях в зависимости от массы реагирующих веществ. По вопросу о непостоянстве состава соединений и изменчивости сил химического сродства Бертолле вёл длительную полемику с Ж. Л. Прустом.
В начале XIX в. эта дискуссия завершилась в пользу Пруста и закон постоянства состава получил признание большинства химиков. Однако в начале XX в. Н. С. Курнаков открыл существование предвиденных Бертолле химических индивидуальных веществ переменного состава, которые в память Бертолле назвал бертоллидами. Это открытие разрешило противоречие между казавшимися несовместимыми взглядами Бертолле и Пруста на состав тел.
В честь Клода Луи Бертолле назван род южноамериканских растений Бертолетия (Bertholletia), с которому относится широко известный вид Бертолетия высокая (Bertholletia excelsa), или Бразильский орех.