Ребёнком упал на горящие угли, изуродовал себе правую руку (впоследствии сделал несколько блестящих графических этюдов покалеченной руки). Учился витражному искусству у отца, с 1575 учился гравировальному мастерству. В 1577 поселился в Харлеме. В 21 год женился на много старшей себя, но богатой вдове, что дало ему экономическую самостоятельность. Тем не менее, он в 1590 сбежал от нее, путешествовал по Германии и Италии, где открыл для себя творчество Рафаэля, но особенно впечатлился работами Микеланджело. Оставил портрет Джамболоньи (1591).
В 1600 возглавил Харлемскую академию живописи. С этого же времени выступил как живописец и, хотя начал поздно, оставил ряд замечательных работ (Даная, 1603, и др.). Гораздо более он был известен современникам как виртуозный гравёр. Среди прочего, он гравировал картины знаменитого в ту пору мастера Бартоломеуса Шпрангера, Корнелиса Харлемского и др.
Ряд работ Гольциуса хранится в Эрмитаже.