Глэдис Купер родилась 18 декабря 1888 года в Лондоне, одной из трёх дочерей Чарльза Уильяма Фредерика Купера и Мэйбл Барнетт.
Её дебют на театральной сцена состоялся в 1905 году во время гастролей мюзикла «Колокольчики в сказочной стране». В дальнейшие годы она активно участвовала в различных постановках английских театров, а в 1917 году состоялся её дебют в кино в фильме «Одиннадцатая заповедь». В молодости Глэдис Купер также была популярной фотомоделью.
С начала 1940-х годов актриса начала свою карьеру в Голливуде, где часто играла статных аристократок. В подобном амплуа она появилась в таких фильмах как «Ребекка» (1940) и «Леди Гамильтон» (1941). Глэдис Купер трижды номинировалась на премию «Оскар» за лучшую роль второго плана в фильмах «Вперед, путешественник» (1942), «Песня Бернадетт» (1943) и «Моя прекрасная леди» (1964).
С 1964 по 1965 год актриса исполняла роль Маргарет Сент Клер в телесериале «Жулики», где наряду с ней снимались Дэвид Нивен и Шарль Буайе, за роль которой в 1965 году была удостоена премии «Золотой глобус». На телевидении у неё также были роли в телесериалах «Театр 90», «Сумеречная зона» и «Бен Кэйси».
В 1968 году, в возрасте почти 80 лет, Глэдис Купер был присуждён титул Дамы-Командора Ордена Британской империи.
Актриса трижды была замужем. Её первым мужем, за которого она вышла в 1908 году, был капитан Герберт Букмастер. Он также стал отцом её двоих детей. С 1927 по 1936 год она была замужем за баронетом сэром Нэвиллом Пирсом, от которого родила дочь. В 1937 году Глэдис Купер вышла замуж за английского актёра Филипа Мэривейла. Купер в течение долгого времени жила в Санта-Монике, штат Калифорния, как постоянный иностранный резидент, вместе с третьим мужем до его смерти от сердечного приступа в 1946 году.
Будучи уже пожилой дамой Глэдис Купер вернулась в Великобританию, где и умерла от пневмонии 17 ноября 1971 году в городе Хэнли-на-Темзе, графство Оксфордшир.