При нём была основана бразильская колония, португальцы овладели Молуккскими островами, восстановлен университет в Коимбре, приняты иезуиты и введена инквизиция. По своим масштабам преследование еретиков в Португалии превзошло даже то, что творилось в других частях Пиринейского полуострова. Иезуиты приобрели огромное влияние в стране. Король, королева и инфанты слушались их внушений. Иезуиты проникли во все слои общества, овладели университетами и стали господствовать над общественной жизнью Португалии.
С 1525 года женат на дочери короля Кастилии Филиппа I Екатерине Австрийской. От этого брака родились:
Все шесть сыновей Жуана III умерли раньше своего отца, поэтому корону унаследовал его внук Себастьян, сын принца Жуана. Жуан III был сторонником Карла V.