Родился в семье конторщика бумажной фабрики Исаака Файвеловича Эйтингона и Евгении Гранат. Двоюродный брат М. Е. Эйтингона. Член партии левых эсеров с 1917 года. С 1918 года — в Красной Армии, с 1919 года — сотрудник Гомельской ЧК. Член РКП(б) с 1920 года.
В операции против савинковских бандгрупп в 1921 году тяжело ранен. После окончания Военной академии (1925) — на работе в Китае (1925), затем — в Турции (1928). В 1930—1932 годах — помощник Я. И. Серебрянского в Управлении специальных операций, затем руководитель секции нелегальных операций ИНО ОГПУ.
В 1936—1938 годах — заместитель резидента в Испании А. М. Орлова. Известен как «генерал Л. А. Котов» (во время Гражданской войны в Испании), Грозовский, Леонов, Наумов, тов. Пабло и др.
Занимался организацией диверсий и актов террора за рубежом, в частности, таких как убийство диктатора Северного Китая и Манчжурии Чжан Цзолиня, похищение видных участников белого движения генералов А. П. Кутепова и Е. К. Миллера во Франции. Вероятно, причастен к судьбе «тройного агента» Н. В. Скоблина в Испании. Организовал вывоз в СССР испанского государственного золотого запаса. Совместно с П. А. Судоплатовым разработал и подготовил операцию «Утка» в Мексике, в ходе которой агент Рамон Меркадер убил Л. Д. Троцкого.
В 1941—1942 годах участвовал в акциях, обеспечивавших нейтралитет Турции во Второй мировой войне.
В 1942 году назначен заместителем начальника 4-го управления НКВД СССР, занимавшегося разведкой, террором и диверсиями в тылу противника. В этом качестве (заместитель П. А. Судоплатова) провел оперативные игры «Монастырь», «Курьеры», «Березино», «Арийцы».
В 1944 году, в ходе операции «Березино», оперативная группа НКВД под его непосредственным командованием захватывает и перевербовывает диверсантов Скорцени, в белорусских лесах (в составе группы работал и В. Г. Фишер, ставший позднее известным как Рудольф Абель).
С 1945 года заместитель начальника отдела «С» НКВД (затем НКГБ) СССР, которому было поручено добывание и обобщение разведданных по созданию ядерного оружия.
В послевоенные годы возглавлял операции по подавлению националистического подполья («Лесных братьев») в Литве и Западной Белоруссии. Был организатором политических убийств деятелей украинского националистического движения: бывшего советского функционера А. Шумского и греко-католического епископа Т. Ромжи. Руководил ликвидацией «врагов советской власти», гласное осуждение и казнь которых были невозможны по ряду причин: Наума Самета, инженера-судостроителя, уличенного в выдаче за рубеж технических сведений, Исаака Огинса, американского гражданина, переметнувшегося агента Коминтерна.
В октябре 1951 года был арестован по «делу о сионистском заговоре в МГБ» в рамках развернувшейся борьбы с космополитизмом. После смерти И. В. Сталина был освобожден по ходатайству П. А. Судоплатова и назначен в систему МВД СССР. С мая 1953 года — заместитель начальника 9-го отдела МВД СССР. В августе 1953 года вновь арестован по «делу Л. П. Берии» и приговорен к 12 годам заключения.
В 1964 году освобожден и работал старшим редактором в издательстве «Международные отношения».
Смерть наступила в результате естественных причин.
Похоронен в Москве, на новом Донском кладбище.
Реабилитирован посмертно в 1992 году. Некоторыми исследователями правомерность его реабилитации оспаривается.
Был женат на Анне Шульман, Ольге Зарубиной (Наумовой). С 1941 года в браке с Музой Григорьевной Малиновской (Вихревой).
Дети: Сын — Эйтингон Владимир Наумович (род. 1924); дочь — Уруцкоева Светлана Наумовна (род. 1927), сын - Эйтингон Леонид Наумович (р. 1943 г.) и дочь - Малиновская Муза Наумовна (р. 1947 г.), автор книги "На предельной высоте" о жизни Н.И. Эйтингона и М.Г. Малиновской, которая, без преувеличения, проходила на пределе человеческих возможностей.
Внуки — Эйтингон Елена Владимировна, Уруцкоев Леонид Ирбекович , Уруцкоева Елена Ирбековна, Эйтингон Галина Леонидовна, Эйтингон Анастасия Леонидовна, Ефремов Александр Геннадьевич, Ефремов Игорь Геннадьевич.
Награждён двумя орденами Ленина, двумя орденами Красного Знамени, орденами Суворова II степени и Отечественной войны I степени, двумя орденами Красной Звезды.