Был четвёртым ребёнком в семье известного русского врача Сергея Боткина (лейб-медика Александра II и Александра III) и Анастасии Александровны Крыловой.
В 1878 г. на основе полученного дома воспитания был принят сразу в 5-й класс 2-й Петербургской классической гимназии. После окончания гимназии в 1882 г. поступил на физико-математический факультет Петербургского университета, однако, сдав экзамены за первый курс университета, ушёл на младшее отделение открывшегося приготовительного курса Военно-медицинской академии.
В 1889 году окончил академию третьим в выпуске, удостоившись звания лекаря с отличием.
С января 1890 г. работал врачом-ассистентом в Мариинской больнице для бедных. В декабре 1890 г. на собственные средства командирован за границу для научных целей. Занимался у ведущих европейских учёных, знакомился с устройством берлинских больниц.
По окончании командировки в мае 1892 г. Евгений Сергеевич стал врачом придворной капеллы, а с января 1894 г. вернулся в Мариинскую больницу сверхштатным ординатором.
8 мая 1893 г. защитил в академии диссертацию на соискание степени доктора медицины «К вопросу о влиянии альбумоз и пептонов на некоторые функции животного организма», посвящённую отцу. Официальным оппонентом на защите был И. П. Павлов.
Весной 1895 г. был командирован за границу и два года провёл в медицинских учреждениях Гейдельберга и Берлина, где слушал лекции и занимался практикой у ведущих немецких врачей — профессоров Г. Мунка, Б. Френкеля, П. Эрнста и других. В мае 1897 г. избирается приват-доцентом Военно-медицинской академии.
В 1904 году с началом Русско-японской войны убыл в действующую армию добровольцем и был назначен заведующим медицинской частью Российского общества Красного Креста (РОКК) в Маньчжурской армии. «За отличия, оказанные в делах против японцев» был награждён офицерскими боевыми орденами — орденами Святого Владимира III и II степени с мечами, Св. Анны II степени, Св. Станислава III степени, сербским орденом Св. Саввы II степени и болгарским — «За гражданские заслуги».
Осенью 1905 г. Евгений Боткин возвратился в Петербург и приступил к преподавательской работе в академии. В 1907 г. назначается главным врачом общины святого Георгия.
По просьбе Императрицы Александры Фёдоровны был приглашён как врач в царскую семью и в апреле 1908 г. назначен лейб-медиком Николая II. Пробыл в этой должности до своей гибели.
Также являлся совещательным членом Военно-санитарного Учёного комитета при Императорской Главной квартире, членом Главного управления Российского общества Красного Креста. Имел чин действительного статского советника.
В 1917 году, после падения монархии 2 (15) марта, остался вместе с царской семьёй в Царском Селе, а затем последовал за ней в ссылку. В Тобольске открыл бесплатную медицинскую практику для местных жителей. В апреле 1918 года вместе с царской четой и их дочерью Марией был перевезён из Тобольска в Екатеринбург.
Был расстрелян вместе со всей императорской семьёй в Екатеринбурге в Ипатьевском доме в ночь с 16 на 17 июля 1918 года.
Согласно воспоминаниям бывшего австрийского военнопленного, перешедшего на сторону большевиков, И. Л. Мейера, опубликованным в журнале «7 TAGE» 14—25 июля 1956 года, революционный штаб предлагал Боткину свободу и работу в Москве, тот, понимая, что погибнет вместе с царской семьёй, тем не менее отказался. Однако сами «Воспоминания Мейера», скорее всего, фальсификация.
Канонизирован РПЦЗ в 1981 году вместе с другими расстрелянными в доме Ипатьева — и Романовыми, и их слугами. Решение РПЦ было иным. Комиссия по канонизации, возглавляемая митрополитом Ювеналием, рассматривая вопрос канонизации царской семьи, отметила, что:
30 октября 2009 года Генеральная прокуратура Российской Федерации приняла решение о реабилитации 52 человек из окружения императора Николая II и его семьи, подвергшихся репрессиям после революции. В числе реабилитированных был и Евгений Боткин.
У Евгения Боткина было четверо детей: Юрий, Дмитрий, Глеб и Татьяна. В 1910 г. Боткин развёлся с женой (Ольгой Владимировной).
Сын Дмитрий — хорунжий лейб-гвардии казачьего полка — погиб в Первую мировую войну (3 декабря 1914 г. он прикрывал отход разведывательного казачьего дозора). Награждён посмертно Георгиевским крестом IV степени.
После революции Татьяна и Глеб Боткины последовали за отцом в ссылку в Тобольск, но в Екатеринбург власти их не пустили. После разгрома белых Татьяна и Глеб уехали в эмиграцию. За границей Татьяна Боткина (в замужестве Мельник) написала «Воспоминания о Царской семье», где упоминала и о своём отце. Мемуары оставил и Глеб Боткин.
В настоящее время во Франции живёт внук Боткина — Константин Константинович Мельник-Боткин (сын Татьяны Боткиной и Константина Мельника — всего у них было трое детей), который координировал деятельность французских спецслужб в 1960-х годах.