Родился в Кастель Нуово (предместье Неаполя) в семье испанского солдата, женатого на итальянке. Свои труды позже подписывал фамилией матери: Борелли.
Сведения о его ранней биографии скудны. Учился в Риме, изучал медицину и математику у Кастелли (вместе с Торричелли). С 1635 года работал в университете Мессины, с 1649 года — профессор математики. Примерно в начале 1640-х познакомился с Галилеем.
В 1656 году Борелли занял кафедру математики в Пизанском университете. Здесь он познакомился с врачом Марчелло Мальпиги, который одним из первых начал исследования с помощью микроскопа. Борелли также увлёкся этой тематикой и получил ряд ценных результатов.
В 1668 году Борелли вернулся в Мессину, но вскоре на него пали подозрения в участии в политическом заговоре, и он вынужден был бежать из города. Остаток жизни он провёл в бедности, работая школьным учителем в Риме. Его главный труд по биомеханике, «О движении животных», был издан посмертно (1680).
Борелли считается основоположником биомеханики. Его двухтомный труд «О движении животных» (лат. De Motu Animalium) рассматривает организм животного с точки зрения математической теории механизмов. Особенно подробно он исследовал работу мускулов. Например, сердце он рассматривал как насос с клапанами, легкие — как два меха, а процесс ходьбы — как целенаправленное перемещение центра тяжести, сопровождаемое мерами по восстановлению равновесия.
Борелли исследовал как статику, так и динамику тела, оценил силу, развиваемую мускулами при разных видах активности (ходьба, бег, прыжки, поднятие тяжестей). Он рассмотрел также полёт птиц, плавание рыб и скольжение червей. Эта работа неоднократно переиздавалась и оказала большое влияние на теоретическую медицину.
Борелли продолжил систематическое изучение открытых Галилеем спутников Юпитера. В своей книге «Теория Медичийских планет» (1666) он сделал исключительно важный на тот момент вывод, что для них, как и для планет, выполняются законы Кеплера. В этой же книге он одним из первых сформулировал несовершенный, но принципиально верный вариант закона всемирного тяготения, предположив, что движение планет происходит в обстановке равновесия между притяжением к Солнцу и некоторой центробежной силой, аналогичной той, которая выбрасывает камень из пращи. Борелли так описал механизм движения под действием тяготения:
В книге ясно видно, насколько плодотворным оказалось применение к модели Кеплера «новой механики» Галилея, которая оказалась способной пусть не количественно, но качественно верно объяснить (не раскрытую Кеплером) причину движения планет. Борелли правильно объясняет и причину отклонения планетной орбиты от круга: форма орбиты зависит от начального соотношения двух указанных сил.
Примерно в эти же годы к аналогичным выводам пришли Кристофер Рен, Роберт Гук и Исаак Ньютон; последний, завершив математизацию основ небесной механики, назвал Борелли в числе своих предшественников.
Борелли впервые рассмотрел возможность создания дыхательного аппарата для подводных исследований. Он также изучал под микроскопом состав крови животных и работу устьиц растений.
В 1660 году Борелли и Вивиани провели довольно точное измерение скорости звука и получили значение, соответствующее примерно 350 м/сек. Более ранние измерения, выполненные Гассенди, оценивали скорость звука в 478 м/сек (современная оценка: 331,3 м/сек при 0 °C).
Борелли по-видимому, первый заметил, что атмосферное давление связано с погодой: «Когда в каком-то районе надвигается длительный дождь, тогда ртуть в трубке поднимается на несколько градусов против обычного уровня; когда же дождь уже идёт, уровень ртути в трубке обычно падает, и эти различия уровня ртути не столь уж ничтожны». Борелли отметил (1670), что высота подъёма жидкости по капиллярной трубке обратно пропорциональна диаметру капилляра.
Борелли издал с собственными подробными комментариями «Начала» Евклида (1658) и три книги «Конических сечений» Аполлония (1661).