Родился в семье небогатого дворянина, владельца небольшого поместья в Йоркшире. В 16 лет поступил в Оксфордский университет, где сначала получил степень бакалавра теологии, затем доктора теологии. Занимался работами по физике, математике, логике, астрономии. Богословской деятельностью занялся после переговоров с нунцием папы Григория XI в Брюгге летом 1374 года, где протестовал против злоупотреблений Римской курии в Англии, отстаивая тем самым антиклерикальную позицию английского правительства. Королевская власть в Англии тяготилась своей зависимостью от папства, особенно ввиду враждебной политики пап, которые находились в Авиньоне и поддерживали Францию в Столетней войне.
В 1376—1377 годах Уиклиф читал курс лекций, в которых осуждал алчность духовенства, ссылаясь на то, что ни Христос, ни его апостолы не обладали ни имуществом, ни светской властью. В 1377 году был привлечён Лондонским епископом к суду прелатов за антипапские высказывания. В 1378 году папа издал специальную буллу, осуждающую учение Уиклифа, однако благодаря заступничеству королевского двора и Оксфордского университета, Уиклифу удалось сохранить свободу. Смерть Григория XI и последовавший за ней папский раскол спасли его от дальнейших преследований со стороны Рима.
После поражения крестьянского восстания 1381 года придворные и дворянство отошли от Уиклифа. Под давлением Кентерберийского архиепископа Оксфордские богословы осудили 12 его тезисов, признав их еретическими. Уиклиф и его последователи были изгнаны из Оксфордского университета, а затем отлучены от церкви. После этого Уиклиф скрылся в Латтерворте, где занимался переводом Библии на среднеанглийский язык и написал свой главный труд «Триалог», в котором изложил свои реформаторские мысли. 31 декабря 1384 года Джон Уиклиф умер от инсульта.
Взгляды Уиклифа были повторно осуждены на Римском соборе в 1412 году и на Констанцском соборе в 1415 году. Останки Уиклифа были сожжены согласно постановлению собора.
Отход Уиклифа от ортодоксии начался в 1376 году курсом лекций в Оксфорде на тему «О гражданском владении». Уиклиф выдвинул теорию, согласно которой право на владение и собственность даются лишь праведностью; неправедное духовенство лишено такого права; право решать, следует сохранить собственность тому или иному церковнику или нет, должно быть предоставлено гражданской власти. Далее Уиклиф учил, что собственность является плодом греха; Христос и апостолы не имели никакой собственности, и священники также не должны иметь никакой собственности. Эти доктрины вызвали негодование всего духовенства, кроме членов нищенствующих орденов. Уиклиф выступал против притязаний папства на взимание поборов с Англии и защищал право короля на секуляризацию церковных земель. Идеи Уиклифа, особенно в отношении секуляризации церковных земель, пользовались поддержкой королевского правительства и некоторых крупных феодалов во главе с Джоном Ланкастером.
Уиклиф отвергал епископскую степень, учение о чистилище и индульгенциях; не признавал необходимым таинство елеосвящения; устную исповедь считал насилием совести и потому предлагал довольствоваться внутренним раскаянием человека перед Богом. Одним из ключевых пунктов его взглядов было отрицание таинства пресуществления: Уиклиф выступал против учения о действительном присутствии Христа в евхаристии, допуская только его духовное присутствие. Уиклиф учил, что каждый человек прямо связан с Богом без каких-либо посредников. Следовательно, церковь как промежуточное звено между человеком и Богом не нужна. Для обеспечения возможности прямой связи человека с Богом Уиклиф требовал перевести Библию с традиционного латинского языка на национальные и использовать её только в переводе.
На протяжении 1378 и 1379 годов Уиклиф продолжал писать учёные трактаты, в которых отстаивал мнение, что король — это наместник Бога и что епископы подвластны королю. После наступления Великого западного раскола в 1378 году, Уиклиф стал клеймить папу как антихриста и утверждать, что принятие Константинова дара сделало всех последующих пап отступниками. В этот период он побудил своих последователей взяться за перевод Библии на английский язык. После осуждения комиссией в Оксфордском университете его взглядов на евхаристию как еретических Уиклиф был вынужден удалиться из Оксфорда в Латтерворт. Это решение было подтверждено с ещё более строгой формулировкой на соборе в Блэкфрайаре (Лондон) архиепископом Кентерберийским в мае 1382 года, когда небольшую группу оставшихся у него учеников вынудили отречься от его взглядов. К тому времени, однако, учение Уиклифа распространилось за пределы университета и сохранялось в вульгаризированной форме усилиями небольшого числа ревностных, но необразованных проповедников — лоллардов.
Учение Уиклифа и при его жизни, и после смерти до самой Реформации было популярно в низших слоях населения как в Англии, так и в материковой Европе, особенно в Чехии, где его идеи были подхвачены реформатором Яном Гусом и его последователями гуситами. В 1415 году по решению Констанцского собора Уиклиф и Гус были признаны еретиками, в результате чего Ян Гус был сожжён на костре. По решению Констанцского собора останки Уиклифа были выкопаны из земли и сожжены в 1428 году.