В 1940 году Дифенбейкер был избран в парламент от Консервативной партии Канады. Он трижды был соперником руководства партии на конвенциях в 1942, 1948, а в 1956 возглавил ее.
В 1957 году, когда консерваторы победили на федеральных выборах и сформировали правительство меньшинства, Дифенбайкер занял пост премьер-министра Канады. В 1958 году партия Дифенбейкера победила на федеральных выборах, и он сформировал правительство большинства.
Во время правления своей администрации, Дифенбейкер аннулировал «Проект Авро CF-105 Канада Арроу» (англ. Avro Canada CF-105 Arrow) и закупил военные самолеты американского производства, что было спорным решением в истории Канады.
Среди весомых достижений Дифенбейкера в должности председателя правительства:
В 1963 году Дифенбейкер проиграл федеральные выборы Лестеру Боулсу Пирсону, представителю Либеральной партии Канады.
Дифенбейкер ушел в отставку с поста лидера Консервативной партии Канады в 1967, но оставался членом парламента до своей смерти в 1979 году.
В 1969 году он стал ректором Саскачеванского университета и занимал эту должность до своей смерти.