По окончании в 1884 году Ришельевской гимназии в Одессе, поступил на естественное отделение физико-математического факультета Новороссийского университета, где работал под руководством А. О. Ковалевского и Ф. М. Каменского. По окончании Университета два года работал на Одесской бактериологической станции, основанной И. И. Мечниковым, а затем поступил на медицинский факультет Императорского Университета святого Владимира в Киеве, который окончил в 1904 году. В 1893 году Д. Заболотный вместе с И. Савченко исследовал проблему иммунизации человека против холеры. Руководствуясь опытами Klemperer’а, молодые исследователи изучали способы иммунизации человека, путем введения реагентов через желудочно-кишечный тракт. Они повторили опыты Klemperer’а над собой и еще двумя другими добровольцами. Став по назначению военным врачом, работал два года в Киевском военном госпитале и в лаборатории общей патологии профессора В. В. Подвысоцкого.
В 1894 году, сразу после окончания медицинского института, Заболотный начал свою работу в качестве эпидемиолога на эпидемии холеры и дифтерии в Подольской губернии. Здесь он провел испытание эффективности противодифтерийной сыворотки на самом себе после экспериментального заражения дифтерией.
С 1897 году участвовал в командировках для изучения тропических болезней (чумы и холеры) в Индию, Аравию, Китай, Персию (ныне — Иран). Работал год в Институте Пастера в Париже. С 1899 года читал курс бактериологии слушательницам Женского медицинского института и состоял в качестве специалиста-бактериолога в Институте экспериментальной медицины.
Участвовал в ликвидации эпидемии чумы на Дальнем Востоке 1910—1911 годов.
Создал учение о природной очаговости чумы (1922). В 1898 году организовал в Петербургском женском медицинском институте первую в России кафедру бактериологии (заведовал ею до 1928 года), в 1920 году в Одессе — первую в мире кафедру эпидемиологии. В 1921 году основал и был первым ректором Одесского медицинского института. В 1923 году Военно-медицинской академии основал кафедру микробиологии и эпидемиологии с курсом дезинфекции. Организовал в 1928 году в Киеве Украинский институт микробиологии и вирусологии АН УССР, носящий ныне его имя. Один из основателей Международного общества микробиологов. Руководил Санитарно-эпидемиологической комиссией Главного военно-санитарного управления Красной Армии, был членом Учёного медицинского совета Наркомздрава, организатором курсов военных и гражданских врачей-эпидемиологов. Депутат Петроградского и Киевского советов, член ЦИК СССР и Всеукраинского ЦИК. Автор многочисленных научных работ о чуме, холере, малярии, сифилисе, дифтерии, сыпном тифе и др. заболеваниях.
Умер академик Заболотный Д.К. 15 декабря 1929 года в Киеве, будучи президентом Всеукраинской Академии Наук.
В честь Д. К. Заболотного в Киеве названа улица (массив Феофания). В честь Д. К. Заболотного названа улица в городе Одессе на районе имени Котовского улица в Гурьеве,ныне переименована.