Барбара О’Нил родилась в Сент-Луисе, штат Миссури. Актёрскую карьеру начала с выступления в театре университета города Кейп Коб, под руководством Джошуа Логана, за которого впоследствии вышла замуж. В 1937 году состоялся её дебют в кино в фильме «Стелла Даллас», а в 1939 год она сыграла мать Скарлет О’Хара в «Унесённых ветром».
Год спустя актриса появилась в фильме «Всё это и небо в придачу», где сыграла герцогиню Празлинскую, за роль которой была номинирована на «Оскар» как лучшая актриса второго плана. В дальнейшие годы актриса появилась ещё в восьми кинокартинах, среди которых нуар «Ангельское лицо» (1952) с Джин Симмонс и драма «История монахини» (1959) с Одри Хепбёрн.
Барбара О’Нил умерла от сердечного приступа в сентябре 1980 года в возрасте 70 лет.