Как глава Боевой организации эсеров, организовал и успешно провел ряд терактов, в числе которых — убийство Великого князя Сергея Александровича. В то же время, как агент Охранного отделения, раскрыл и сдал полиции множество революционеров.
Евно Азеф родился в октябре 1869 года в местечке Лысково Гродненской губернии в семье бедного портного-еврея. Участвовал в кружках революционной еврейской молодёжи. В 1890 году окончил гимназию в Ростове-на-Дону. В 1892 году, скрываясь от полиции, украл 800 рублей (по другой версии, продал украденную у знакомого купца партию масла) и бежал в Германию, где устроился учиться на инженера-электротехника в Карлсруэ. В число секретных сотрудников полиции Азеф был принят в 1892 году. 4 ноября 1893 года предложил Департаменту полиции быть осведомителем о русских революционерах — студентах политехнического института в Карлсруэ, и его предложение приняли. Первоначальный оклад Азефа составлял 50 рублей. В 1899 году женился на Любови Григорьевне Менкиной, имел двоих детей.
В 1899 году вступил в союз социалистов-революционеров. После ареста Г. А. Гершуни в 1903 году Азеф остался центральной фигурой и возглавил Боевую Организацию эсеров, осуществляющую террористические акты. Партийные псевдонимы Азефа — «Иван Николаевич», «Валентин Кузьмич», «Толстый». В контактах с Департаментом полиции он использовал псевдоним «Раскин».
Созданную Гершуни Боевую Организацию Азеф реорганизовал, сделав её компактной, централизованной, строго дисциплинированной и легко управляемой. Сам Азеф с поддержкой М. Р. Гоца активно продвигал террор, при этом предотвращая некоторые террористические акты (покушение на министра внутренних дел П. Н. Дурново, на царя Николая II). В то время его жалование от Охранного отделения достигло 1000 рублей в месяц.
Выдал весь первый состав ЦК ПСР и некоторых эсеров-боевиков (С. Н. Слётова, Г. И. Ломова, М. А. Веденяпина, А. В. Якимову, З. В. Коноплянникову и др.), а также некоторые планы и коммуникации революционеров. Одновременно организовал более 30 террористических актов, осуществил убийства видных представителей царского государственного аппарата, в том числе своих начальников: министра внутренних дел и шефа корпуса жандармов В. К. Плеве (которого считали главным организатором еврейского погрома в Кишинёве в 1903 г.), генерал-губернатора Москвы великого князя Сергея Александровича, Петербургского градоначальника В. Ф. фон дер Лауница, главного военного прокурора В. П. Павлова. Для того, чтобы избежать раскрытия, часть терактов он готовил в тайне от Департамента полиции, прилагая все усилия для их осуществления. О других — своевременно сообщал в охранку, и они соответственно проваливались. Благодаря этому Азефа считали «своим» и члены партии и полиция. Каждый раз, когда его пытались разоблачить, кто-нибудь из революционеров «доказывал», что человек, организовавший столько успешных террористических акций, не может быть агентом охранки; для Охранного отделения Азеф также представлял большую ценность.
Он же (с участием представителей других революционных партий Конни Циллиакуса, Георгия Деканозова и др.) организовал закупку на деньги японского военного атташе М. Акаси оружия для рабочих и его доставку в Россию на пароходе «Джон Графтон». По ряду данных, Азеф инициировал ликвидацию Г. А. Гапона как «провокатора», что и было исполнено боевиками П. М. Рутенберга. Об этом же свидетельствует в своих воспоминаниях сам Рутенберг. После Манифеста 17 октября Азеф стал сторонником роспуска Боевой Организации и всячески саботировал её действия, в результате чего эсеры перешли к террору с помощью децентрализованных летучих отрядов.
Результатом последнего предательства Азефа, перед разоблачением, был арест полицией и казнь членов Летучего Боевого отряда партии социалистов-революционеров в феврале 1908 года. Эта казнь послужила сюжетом Леониду Андрееву при написании «Рассказа о семи повешенных».
После наступления реакции Азеф готовил покушение на Николая II, для чего рассматривались весьма авантюрные схемы. В частности, с подачи Азефа ЦК ПСР выделял деньги на проектирование и строительство специальной подводной лодки и самолёта для совершения теракта. Однако в 1908 году Азеф был разоблачён как провокатор публицистом В. Л. Бурцевым (подтвердившим свои подозрения у бывшего директора Департамента полиции А. А. Лопухина). На внутрипартийном разбирательстве ЦК ПСР приговорил Азефа к смерти, однако тот смог избежать ликвидации и скрылся за границей. В дальнейшем жил в Берлине под видом рантье Александра Неймайера (Alexander Neumayr) по документам, выданным министерством иностранных дел России. Тщательно избегал контактов с представителями царских властей и русскими революционерами, но в 1912 году встретил на курорте во Франции Бурцева. Азеф принялся ему доказывать, что сделал для революции гораздо больше пользы, чем ему приписывают вреда как провокатору, и требовал справедливого суда ЦК, однако затем снова скрылся.
После начала Первой мировой войны Азеф разорился, так как все его средства были вложены в русские ценные бумаги. Чтобы хоть как-то сводить концы с концами, открыл в Берлине корсетную мастерскую. В июне 1915 года немецкая полиция арестовала его как бывшего русского секретного агента. Содержался в тюрьме Моабит, был освобожден только в декабре 1917 года.
В тюрьме он заболел и 24 апреля 1918 года умер от почечной недостаточности в берлинской клинике «Krankenhaus Westend». Был похоронен в Берлине в безымянной могиле за № 446. Захоронение до нашего времени не сохранилось.
На языке партийных революционеров «провокатором» называлось любое лицо, сотрудничавшее с Департаментом полиции. Революционная терминология не знала разницы между агентом-осведомителем и агентом-провокатором. Всякий революционер, уличённый в сношениях с полицией, объявлялся «провокатором», и на этом ставилась точка. Между тем, с юридической точки зрения, между простым агентом-осведомителем и агентом-провокатором существовала большая разница. Агентом-провокатором именовался только тот секретный сотрудник, который принимал активное участие в революционной деятельности или подстрекал к этому других. С точки зрения закона, такие действия секретных сотрудников считались преступными и подлежали уголовной ответственности. В циркулярах Департамента полиции указывалось, что секретные сотрудники не должны участвовать в противозаконной деятельности или подстрекать к ней других лиц.
После разоблачения Азефа, когда его история была предана гласности, в обществе возник вопрос, был ли Азеф агентом-провокатором. Обнародованные Владимиром Бурцевым и партией эсеров материалы свидетельствовали, что Азеф, будучи секретным сотрудником, принимал активное участие в террористической деятельности. Стоя во главе Боевой организации эсеров, он руководил её деятельностью, готовил террористические акты и посылал на них других людей. Это означало, что, в строгом соответствии с юридической терминологией, Азеф являлся агентом-провокатором и должен был быть привлечён к уголовной ответственности. Между тем, Азеф к уголовной ответственности привлечён не был, а правительство отрицало его причастность к террористическим актам. По версии правительства, Боевой организацией эсеров руководил не Азеф, а Борис Савинков, тогда как Азеф был простым осведомителем, дававшим правительству ценные сведения о преступных замыслах революционеров.
Вопрос о провокаторстве Азефа обсуждался многими его современниками. В итоге причастность Азефа к террористическим актам была признана не только революционерами, но и его бывшими полицейскими начальниками, такими как Л. А. Ратаев, А. А. Лопухин, С. В. Зубатов и А. И. Спиридович. В частности, генерал Спиридович в своих мемуарах писал: «Азеф — это беспринципный и корыстолюбивый эгоист, работавший на пользу иногда правительства, иногда революции; изменявший и одной и другой стороне, в зависимости от момента и личной пользы; действовавший не только как осведомитель правительства, но и как провокатор в действительном значении этого слова, то есть самолично учинявший преступления и выдававший их затем частично правительству, корысти ради». На сегодняшний день провокаторство Азефа признаётся за факт большинством исследователей, а отрицание этого факта является маргинальной точкой зрения. Характерным примером преступной деятельности Азефа является его участие в убийстве Георгия Гапона и в убийстве провокатора Н. Ю. Татарова, безуспешно пытавшегося открыть глаза руководству эсеров на провокаторство их партийного лидера.
Одно время собственное имя Азеф даже стало нарицательным для обозначения провокатора и доносчика, в таком качестве упоминается в «Республике Шкид» Г. Белых и Л. Пантелеева в главе про «дело о табаке японском» — первом громком деле в школе.
Азеф как имя нарицательное также упоминается в поэме В. В. Маяковского «Облако в штанах»:
Эту ночь глазами не проломаем,
Чёрную, как Азеф.
В Толковом словаре русского языка под ред. Д. Н. Ушакова (т. 1, 1935 г.) зафиксировано слово «азефовщина» в следующем значении:
Евно Азеф стал прототипом одного из персонажей романа "Петербург" Андрея Белого, провокатора Липпанченки.