Рубен Агамирзян родился Тифлисе (ныне Тбилиси, Грузия); в 1940 году учился в студии Тбилисского русского драматического театра им. А. С. Грибоедова, в 1941 году перешёл в школу-студию Тбилисской киностудии.
Участник Великой Отечественной войны.
В 1946—1948 годах — актёр и режиссёр Русского драматического театра Молдавской ССР в Кишиневе. В 1948—1952 учился на режиссёрском факультете Ленинградского театрального института им. А. Н. Островского (курс Л. С. Вивьена).
В 1953—1961 годах — режиссёр в Ленинградском театре драмы им. А. С. Пушкина, где сотрудничал с Г. Козинцевым во время работы над «Гамлетом» и с Г. Товстоноговым в процессе постановки «Оптимистической трагедии».
В 1961 году был приглашён в БДТ им. М.Горького, где запомнился прежде всего спектаклем «Я, бабушка, Илико и Илларион» по пьесе Нодара Думбадзе.
С 1966 года был главным режиссёром Ленинградского театра им. В. Ф. Комиссаржевской, где за 25 лет работы поставил 51 спектакль.
Среди лучших постановок: «Насмешливое моё счастье» Л. А. Малюгина (1968), «Забыть Герострата!» Г. Горина (1972), «Царь Фёдор Иоаннович» (1972), «Смерть Иоанна Грозного» (1976) и «Царь Борис» (1978) А. К. Толстого, «Святая святых» И. П. Друцэ (1977), «Дни Турбиных» М. А. Булгакова (1983). За постановку трилогии А. К. Толстого в 1984 году был удостоен Государственной премии СССР.
Кроме Ленинграда, Рубен Агамирзян ставил спектакли в театрах Москвы, Минска, Праги, Будапешта, Хельсинки и других городов, в общей сложности более ста спектаклей.
В 1953—1985 годах преподавал в ЛГИТМиК, (ныне Академия театрального искусства), с 1975 года профессор. Среди учеников — Алиса Фрейндлих и Юрий Родионов.
В 1987 году издал книгу «Время. Театр. Режиссер».
Жил на ул. Караванной, 18/37. Умер в Санкт-Петербурге 26 октября 1991 года. Похоронен на Литераторских мостках.
Сын — Игорь Рубенович Агамирзян.